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近岸蛋白质:非洲猪瘟前世今生及其检测方法

2021/6/18 16:42:04 浏览次数:414

6月2日,东部区非洲猪瘟等重大动物疫病分区防控首次联席会议在山东省济南市召开,山东、上海、江苏、浙江、安徽、河南等6省市共同签署《东部区非洲猪瘟等重大动物疫病联防联控框架协议》。


6月3日,为贯彻落实农业农村部《非洲猪瘟等重大动物疫病分区防控工作方案(试行)》要求,加快推进分区防控工作,辽宁、北京、天津、河北、山西、内蒙古、吉林、黑龙江等8省(区、市)联合印发了《北部区非洲猪瘟等重大动物疫病分区防控实施方案(试行)》,北部区8省(区、市)分区防控框架合作协议同时生效。


背景介绍


非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪或野猪引起的一种急性、热性、高度传染性疾病。ASF原发于非洲,软蜱科中的钝缘蜱属Ornithodors)是其自然宿主和传播媒介,该病病程短、死亡率高,世界卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。

非洲猪瘟这个词并不陌生,早在1921年,非洲猪瘟就在非洲肯尼亚被首次发现,在百年间该烈性传染病席卷南美洲、欧洲以及亚洲等多个地区。就在前不久,因非洲猪瘟暴发,菲律宾总统杜特尔特宣布从5月10日起,该国进入为期一年的国家灾难状态。非洲猪瘟导致菲律宾减产约300万头猪,损失超过1000亿比索(约合人民币134亿元)。


ASFV 是非洲猪瘟相关病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属的唯一成员,也是唯一的虫媒传播DNA 病毒。ASFV可在钝缘蜱体内复制并存在几个月到几年,感染蜱再叮咬猪时就会传播该病毒。钝缘蜱是ASF病毒在疫源地传播、长期保存甚至发生变异的关键因素,也是ASF在很多地区和国家久控不绝的重要原因。2019年11月3日在南京举行的中国兽医协会非洲猪瘟防控高峰论坛里,西班牙养猪协会会长Miguel Angle Higuera表示,根据西班牙的经验,没有作为生物媒介软蜱存在的猪场发生非洲猪瘟疫情,复养只需45天, 而有软蜱存在的猪场,则需间隔6年才能复养。此外, 鼠类、蝇类、蚊类在猪场的活跃活动,让其可成为ASFV的重要机械性传播媒介。


ASFV具有独特而复杂的五层结构,从外到内分别是外膜(Outer membrane)、衣壳(Capsid)、内膜(Inner membrane)、核壳(Core shell)以及核心(Nucleoid)。


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ASFV病毒结构示意图


从整体上看,非洲猪瘟病毒衣壳结构跟其他核质大DNA病毒(nucleocytoplasmic large DNA viruses,NCLDVs)衣壳结构较为相似,由20个三重对称壳粒聚集体(Trisymmetron)和12个五重对称壳粒聚集体(Pentasymmetron)组成。其中,每个Trisymmetron由135个壳粒(Capsomer)组成,而每个Pentasymmetron由30个壳粒和1个五邻体(Penton)组成。其基因组为双链闭合线性DNA 分子,基因组大小为170~ 194 kb,含有150~ 167 个开放阅读框(open reading frames,ORF),编码54 种结构蛋白和100 多种非结构蛋白。


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ASFV病毒主要蛋白


病毒复制及感染症状


ASFV 通过内吞或者胞饮作用侵染宿主细胞,其靶细胞主要是单核-巨噬细胞。巨胞饮泡或内吞体中在低pH的环境下,病毒颗粒脱去病毒囊膜,病毒内膜与内体膜融合,暴露病毒基因组。病毒DNA复制与病毒颗粒的组装发生在称为“病毒工厂”-靠近细胞核的特殊胞质区。随后病毒在细胞内组装成成熟的二十面体成熟的病毒颗粒,并通过中进行复制、转录和翻译。基因组和蛋白质组装完成后通过动力蛋白运输到细胞膜附近,经出芽释放到细胞外。

根据GB/T 18648-2020,将该病毒的临床表现分为最急性,急性,亚急性和慢性。具体表现如下:



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疫苗研发


迄今为止疫苗研发进展缓慢,ASFV的复杂性是疫苗研制延迟的一个主要因素。


灭活疫苗迄今尚未成功,可能是因为病毒颗粒有两种感染形式,即细胞外和细胞内成熟,而中和抗体不能完全抑制这些不同病毒的感染。病毒蛋白p72、p54和p30是已知的中和抗体靶点。


减毒活疫苗可诱导高达100%的免疫保护,但是其安全性是个问题,此类疫苗上市仍需要数年时间。


基于单个或多个基因或蛋白的接种的ASF亚单位疫苗可能比减毒活疫苗更安全。重组蛋白p72、p54和p30的组合疫苗,在一项研究中诱导了部分保护;但在另一项研究中却没有。


抗病毒药


ASFV具有许多复制所需的特异性酶类,包括RNA和DNA聚合酶,这些酶应该是抗病毒药物开发的良好特异靶点。有几种化合物已被证明在细胞培养中抑制了ASFV的复制,但到目前为止还没有在猪身上进行过试验,目前暂无上市药物。


因为缺乏疫苗以及特效药,目前控制ASF必须依赖于检疫和屠宰政策以及快速检测。这也是国家和各省市接连出台相关防控政策的重要原因。



常见检测方法


根据GB/T 18648-2020,目前该病毒检测主要分为核酸检测,抗原检测,抗体检测三大类


核酸检测ASFV核酸检测常用普通PCR法,qPCR(荧光定量PCR), 荧光RPA,LAMP等方法。


目前,qPCR检测是该病毒检测的“金标准”,其灵敏度及特异性好,可避免污染假阳性。PCR及qPCR法大多基于非洲猪瘟B646L基因的高度保守区设计也有根据E183L基因、CP530R 基因、CSFV 5 UTR 基因和HP-PRRSV NSP2 基因设计引物和探针。qPCR法检测的灵敏度可比普通PCR法高10~1000倍,已广泛应于ASFV的检测,可以在1h内完成检测。也有部分试剂盒不用核酸提取,直接扩增,但对样品类型要求较高,敏感性也受影响。目前由包括兰州兽医研究所等多家单位共同起草、由中国兽医协会发布的T/CVMA5-2018非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法在我国非洲猪瘟病毒检测中发挥重要作用。


qPCR方法受仪器限制,需要专业的qPCR实验室。等温扩增法LAMP为基层等条件较为落后的实验室提供了一种选择。LAMP利用Bst酶,可在恒温水浴锅的高效,并可肉眼观测结果。LAMP优势是快速、灵敏,可以在30min内完成检测,操作简单,并且不需要特殊的仪器设备,该方法更适合用于田间的快速检测,在基层如屠宰场、养殖场更具有广阔的应用前景。


LAMP方法容易出现交叉污染,出现假阳性。RPA等温扩增技术使用Cre重组酶、单链DNA 结合蛋白(SSB)和Bst酶,30min内可使目的基因得到指数级增长,采用荧光探针标记,使用荧光信号检测仪,可实现对扩增的实时监控。RPA具有较高的灵敏度和特异性,快速,操作简单的优点


根据中国国家兽药基础数据库数据显示,目前国内只有9家企业10个产品获得非洲猪瘟病毒核酸检测试剂的生产批准文号。


表2:获非洲猪瘟病毒检测试剂的生产批准文号产品列表


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近岸蛋白质提供高品质非洲猪瘟核酸检测原料酶/试剂:

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抗原检测:非洲猪瘟病毒抗原检测目前最常用的方法是夹心ELISA抗原检测。ASFV的P30蛋白由CP204L基因编码,具有很强的免疫原性,可诱导机体产生中和抗体,为病毒的早期蛋白,在感染后4h胞浆内即可检测到。GB/T 18648-2020中详细描述了采用P30蛋白单克隆抗体检测相应的抗原。虽然该方法灵敏度低于“金标准“,存在假阴性的缺陷,但是因为其成本比PCR更为低廉且可在没有特殊实验室仪器的设备下操作,可作为急性病例或者大规模的样本筛查辅助方法。


胶体金免疫层析法,操作简单、快速,可以10min内完成检测,不需要仪器读数。但该方法的灵敏度较差,可能会存在假阴性结果。由于其局限性,当前仅适用于病死猪的ASFV检测。有研究以检测P72蛋白建立胶体金法。


同样基于侧向层析的荧光免疫技术,灵敏度比胶体金提高了约100倍,操作比ELISA更简便。该方法内含有大量荧光报告分子,荧光信号强而稳定,不受溶剂的影响,具有极强的抗光漂白能力,采用手持式荧光仪读取数值,人为因素影响小。


抗体检测:ASFV抗体在感染早期(7-10天)就可被检测到,并且会存在数年甚至终生。而ASFV抗体阳性,是机体感染该病毒的最直接证据。GB/T 18648-2020中详细的介绍了ELISA间接、阻断(竞争)、夹心等方法的步骤及结果判读。该方法适用于亚急性、慢性、及大规模血清筛查,但不适用于急性病例(检测到抗体时机体已经死亡)。目前,用于抗体检测的抗原主要是包括P30、P54、P72等蛋白。如INGENASA基于P72特异性抗体的阻断ELISA检测试剂盒,SVANOVIR 基于P30蛋白的间接ELISA检测试剂盒等。


近岸蛋白质提供高品质非洲猪瘟抗原蛋白:

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近岸蛋白质提供非洲猪瘟抗原检测整体解决方案(ELISA),该方法经阳性血样检测,最高稀释5000倍仍有检出,且CV<10%. 数据如下:

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灵敏度:最高可稀释5000倍

当前,我国在非洲猪瘟防控取得了积极的成效,但是疫情已经在我国形成较大的污染面积,疫情仍然有可能爆发。我们必须做到控制传染源,切断传播途径,保护易感动物等相关措施,才能更好的防控疫情。


近岸蛋白质即将上线牛病毒性腹泻病毒(BVDV),蓝耳病毒(PRRSV), 伪狂犬病毒(PRV), 犬瘟热病毒(CDV), 猪流行性腹泻病毒(PEDV)等相关抗原,敬请期待。



参考文献:

Sheng Liu, et al. Cryo-EM Structure of the African Swine Fever Virus [J]. Cell Host&Microbo,26, 836–843

《中华人民共和国国家标准GB/T 18648-2020》

岳龙等. 非洲猪瘟概况综述[J]. 养殖与饲料, 2020 年第05 期

欧云文等. 非洲猪瘟病毒结构蛋白在病毒感染过程中的作用[J]. BIOTECHNOLOGY BULLETIN, 2019, 35(6):156-163


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