旭化成工厂照片

上篇文章中我们介绍了新型层析彩色标记物---纤维素彩色球NanoAct的高灵敏度，低非特异性性能，本篇文章我们分享下NanoAct和抗体偶联操作要点。

11月底我和吉纳公司邢佑尚老师前去日本旭化成延冈市工厂研修NanoAct技术方案学习，在旭化成实验室里面，我们发现了几个很有趣的现象:

01、纤维素彩色球NanoAct和抗体偶联后有凝集沉淀现象，但是测试中灵敏度并不受影响，跟常规的胶体金和彩色胶乳球有很大的不同；

02、偶联后的酪蛋白封闭过程酪蛋白的使用时间会带来封闭效果比较大的差异，Sigma酪蛋白室温20-25℃静置48h之后使用效果最好，过早或过晚结束封闭，都会导致封闭效果不好，影响试剂性能；

03、纤维素彩色球NanoAct比较“耐造”，离心力大小对其没有损伤，离心过程推荐使用13000-20000g比较高的离心力，时间20min参考，离心力过小或者时间较短会导致离心下来的微球在管壁上不牢固，抛液的时候会损失；

04、物理吸附偶联的纤维素彩色球NanoAct，不同抗体和不同颜色的球的最适pH不同，所以三种pH都需要测试筛选一下，找出最适的pH（穷尽法）。

纤维素彩色球NanoAct推荐偶联方法

物理被动吸附型

化学共价偶联型

上述通用方法是厂家和国外厂家共同总结出来的通用标记方法，初步使用是没有问题的，只有在具体项目使用中出现一些具体的问题的时候，才需要对部分条件进行项目适用性优化。

NanoAct 免疫反应条件优化方法

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标记过程中的操作要点分享

1、最佳的免疫反应条件因测定方法 · 抗体 · 微球种类等的不同而不同，因此免疫反应的条件优化很重要。

2、随着pH的变化，抗体吸附量有变化很大的倾向。建议根据三种pH值选择相应缓冲液，并对反应最适pH进行研究。

3、基于甲流检测的性能评价，在上述试验中NanoAct和抗体偶联过程中pH=5酸性条件有凝集，但物理RE1微球的在此条件下的灵敏度反而最高。说明NanoAct与抗体偶联过程中的凝集对灵敏度没有影响。

NanoAct™抗体反应后的情况

将NanoAct、反应缓冲液和抗体混合在一起，于37°C环境中反应2小时后的情况如下图

两种NanoAct均在pH5.0条件下出现沉淀现象,但是性能完全没问题。

被试剂制造商问到“有沉淀了,评估失败对吧?”,经常能听到这样的疑问。

(那是因为胶体金与抗体混合后出现沉淀的情况意味着“免疫反应失败”,但是NanoAct没有问题)

NanoAct™免疫反应条件优化方法

NanoAct™的微粒颜色和反应缓冲液的pH组合带来的性能差异

4、由于抗体性质不尽相同，抗体结合红色或蓝色球哪个效果好，需要测试，使用蓝色球做全血有助于颜色区分；

5、离心过程推荐使用13000-20000g比较高的离心力，时间20min参考，离心力过小或者时间较短会导致离心下来的微球在管壁上不牢固，抛液的时候会损失；

6、NC膜优先推荐CN95的膜，大于95的膜缺点是背景background不干净，容易出现背景色。

其他注意事项

与胶体金的不同点:超声波分散、离心

与胶体金的不同点:抗体吸附

NanoAct:抗体会慢慢吸附在微粒上

✦抗体标记的步骤需要2小时(37℃)

✦(小规模的情况)不用特别搅拌、静置即可

✦虽然会花费时间,但多静置一会就可以了

胶体金:抗体很快就会吸附在微粒上

✦抗体标记的步骤一般需要10~15分钟

✦必须一边搅拌一边迅速添加抗体

✦随着搅拌的方法,抗体添加的方法有微妙的不同的话,也会有性能发生变化的风险

来源：长濑体外诊断IVD